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教你如何正確選擇二抗

作者：admin 信息來源：達科為日期：2015年06月05日打印字體：大中小

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通常情況下，某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到適合該實驗的二抗，需要綜合以下幾個方面進行考慮：

一抗的物種來源

一抗是在什么物種來源的，相應的二抗也要是抗該物種的抗體。例如，如果一抗是在小鼠體內制備的，那么你就應當選擇抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔體內制備的，那么二抗就應當是抗兔的抗體。至于二抗本身是在什么動物中制備的對二抗的質量并無明顯的影響。

一抗是屬于哪個類或亞類

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體。

單克隆抗體的類別及亞類通常會在產品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。

如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。

如果你不知道一抗是哪一類別或亞類，那么抗小鼠IgG是一個不錯的選擇，因為此種抗體可以識別大多數類型的IgG免疫球蛋白。

二抗的特異性

下面總結了幾種具有不同特異性的二抗：針對整個抗體分子（H＋L）具有特異性：如抗IgG(H+L)，此類抗體既可以與抗體的重鏈結合也可以與輕鏈結合，即與抗體分子的Fc，F(ab’)2/Fab部分（見圖5）均可反應，抗IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應（如IgM和IgA），因為所有的免疫球蛋白都具有相同的輕鏈（kappa鏈或lambda鏈）。

針對Fab片段具有特異性：這類抗體與重鏈輕鏈均可以結合，由于它們可以與輕鏈反應，它們同時也已和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應。

這對Fc片段或重鏈具有特異性：這類抗體和重鏈的Fc部分反應，一次它們是類別特異性的（即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應，mu鏈特異性抗體只識別IgM，依此類推）。

輕鏈（kappa，labmda）特異性：與所有類別的抗體反應，因為所有類別的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。

經過吸附處理的二抗（cross-absorbed）：不同來源的免疫球蛋白含有相似的結構，抗一個物種的抗體可能與其他物種發生交叉反應，一次有些二抗經過了動物或人類IgG吸附處理，以減少非特異性背景。例如，如果是小鼠的組織或細胞，那么選擇經小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結合。但是此種抗體識別表位的數量被大大減少。

二抗的形式

選擇哪種形式的二抗，是整個IgG分子，F(ab’)2片段，還是Fab片段？

整個IgG分子：此種抗體適用于多數情況。

F(ab’)2片段：該種抗體是由兩個靠二硫鍵連接的用于結合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況。

Fab片段：它們只有一個結合位點，一般用來封閉內源性免疫球蛋白。

二抗的偶聯標記

一般來講，耦聯到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA，常用的二抗是酶標二抗，而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用biotin/avidin檢測系統。

下面簡單介紹幾種二抗探針的優缺點及其適用的實驗：

酶：主要有兩種不同的酶耦聯物，HRP和AP。比較而言，前者更經濟、快速、穩定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應用于免疫組化，western blot 和 ELISA 中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測實驗，如ELISA和western blot.

熒光基團：

1.FITC：FITC是廣泛使用的熒光基團，但其大的缺點是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。

2.AMCA：常用在多標記實驗中，如免疫熒光、流式細胞術。其缺點是，淬滅快，且由于肉眼不能很好的檢測其所激發的藍色熒光，因而AMCA耦聯的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。

3.花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒光FITC更強。Cy3和Cy5比大多數熒光基團更亮，更穩定，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實驗中作多標記。但Cy5的缺點是不能用表面熒光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡觀察。

4.TRITC,RRX,TR:TRITC經常和FITC一起用于雙標記實驗中，也可以使用RRX或TR，但TR會產生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因為RRX的發射波長在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。